Синтез нуклеиновой кислоты осуществляется с использованием твердофазного метода сиаловых амид-триглицеридов, при котором 3'-конец ДНК иммобилизуется на твердофазном субстрате, а нуклеотиды добавляются в направлении от 3' к 5' до тех пор, пока не будет синтезирован желаемый фрагмент ДНК. .Это отличается от синтеза ДНК применением ДНК-полимеразы.
3'-конец первого основания иммобилизуется на CPG во время синтеза, 5'-ОН следующего основания защищен ди-п-толилтритил-ДМТ, аминогруппа основания защищена бензойной кислотой, а 3'-конец первого основания защищен -ОН затем активируется аминофосфатным соединением.1 основание 5 5'-ОН 1 основания и 3'-ОН следующего основания образуют фосфитный триглицерид, который затем окисляется йодом до фосфатного триглицерида, защитное вещество на втором основании 5'-ОН удаляется прибавление дихлоруксусной кислоты ДМ циклирует через добавление следующего основания, а после синтеза протектор на 5'-ОН удаляют слабой кислотой. Фрагмент отсоединяют от твердой смолы концентрированным гидроксидом аммония, протектор удаляют с основания. концентрированным гидроксидом аммония при нагревании гидроксид аммония удаляют, фрагмент сушат в вакууме и нуклеиновую кислоту очищают жидкостной хроматографией или ПААГ.
Этапы олигосинтеза
Разблокировка
5-концевую защитную группу ДМТ удаляют добавлением раствора ТСА.
Активация
Смешивание активатора с мономером олигонуклеотида с образованием активного промежуточного мономера олигонуклеотида.
Связь
5-концевая гидроксильная группа реагирует с активным промежуточным олигонуклеотидом в реакции антигенеративной конденсации с образованием нестабильной фосфит-триглицеридной связи.
Укупорка
Добавление кэпирующего агента осуществляет реакцию кэпирования ацетилирования с избыточными гидроксильными группами, которые не участвуют в реакции конденсации.
Окисление
Добавление раствора йода, содержащего воду, реагирует с нестабильными фосфитными связями путем окисления с образованием стабильных триглицеридных связей фосфорной кислоты.
Цианоэтильное расщепление
Продукт нуклеиновой кислоты после синтеза с добавлением раствора ДЭА для удаления цианоэтильной группы из фосфат-триглицеридной связи.
Расщепление и снятие защиты
Фрагменты нуклеиновой кислоты отщепляются от твердофазного носителя добавлением концентрированного раствора гидроксида аммония и последующим нагреванием для удаления защитных групп из водородных связей оснований.
Время публикации: 21 ноября 2022 г.